Sequel II Iso-seq数据拆分测评速递~
2019.06.24

此前,安诺基因公布了PacBio Sequel II 平台的多批测试数据,Iso-seq及CLR文库的单张SMRT®Cell产出均有不俗表现。随着Sequel II 平台测序通量的大幅提升,混样测序的需求也接踵而至。近日安诺基因对两批Iso-seq加barcode数据进行了上机测试,数据拆分比例均超过80%,各样品的数据量产出也较为均匀。详细结果请各位看官移目下方数据展示~

1、Iso-seq加barcode混样测试一

样品来源:人源total RNA样品;

测序策略:8个样品分别反转录加不同barcode建库,文库等量混合上机;

测序平台:1张Sequel II 8M SMRT cell ;

测试结果:下机数据共获得653万条polymerase reads,平均酶读长为57 kb,总数据量为370 Gb,去除接头后,subreads总数据量363 Gb。 进一步使用Lima软件对测试数据进行拆分,8个样品共计获得总数据为294 Gb,拆分比例为81%,获得总的CCS reads 364万条。从每个样品的拆分来看,单个样品获得的reads数目有一定的不均一,但处在正常波动范围,数据量最小的样品也能满足subreads>24 Gb,CCS reads数目超过35万条。

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拆分前数据统计表

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拆分后数据统计表

2、Iso-seq加barcode混样测试二

样品来源:人、动物、植物来源的total RNA样品;

测序策略:8个样品分别反转录加不同barcode建库,文库等量混合上机;

测序平台:1张Sequel II 8M SMRT cell ;

测试结果:下机数据共获得528万条polymerase reads,平均酶读长为51 kb,总数据量为269 Gb,去除接头后,subreads总数据量261 Gb。 进一步使用Lima软件对测试数据进行拆分,8个样品获得总数据217 Gb,拆分比例为83%,获得总的CCS reads 262万条。从每个样品的拆分来看,单个样品的拆分均一性较上一次有显著提升,数据均一性很好。

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拆分前数据统计表

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拆分后数据统计表

整体测试评价:

1. Sequel II 平台Iso-seq测序单张SMRT cell 产出超过预期250 Gb,平均获得的polymerase reads数目在500-600万条左右,ZMW小孔利用率达到60%以上;

2. 单张SMRT cell同时混8个样品数据有效拆分比例高达80%以上,符合预期70-80%的标准;

3. 不同样本混样由于定量准确性和文库插入片段的大小分布不一,会造成各样本的数据拆分不均一,但整体浮动不大;

4. 不同的物种、不同样本类型,应根据研究目的选择合适的数据量,目前来看1张Sequel II SMRT cell的产出的reads数目,足够满足绝大多数研究需求。

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数据量推荐

注:以上数据均来自已发表文章,使用PacBio RSII 或Sequel 平台。根据文章中的测序reads数换算成Sequel及Sequel II平台的相应数据量。

目前安诺基因在Iso-seq加barcode混样测序方面已搭建出稳定运行的拆分流程,在拆分速度、拆分比率等方面均有良好表现。此外,多批下机数据显示安诺基因的Sequel II平台运行稳定,高水平的产出和质量可以满足不同的科研需求,助力科研工作的开展,欢迎各位老师们前来咨询、送样~

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