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【生殖生育】胚胎植入前遗传学诊断技术专题

生物探索2017-02-13

导读

自世界首例试管婴儿诞生以来,相继出现了三代试管婴儿技术。技术的发展以及现实需求使第三代试管婴儿技术应用越来越广泛,患者受益越来越显著。然而,第三代试管婴儿技术在临床上应用如何?面临着哪些困境?在全面二孩时代,企业是如何推动我国第三代试管婴儿技术的发展?

世界首例“试管婴儿”于1978年7月25日诞生于英国奧德海姆总医院,我国首例试管婴儿于1988年诞生于北京大学第三医院,迄今为止,全世界已有超过600万例的试管婴儿。自世界首例试管婴儿诞生以来,相继出现了三代试管婴儿技术。技术的发展以及现实需求使第三代试管婴儿技术应用越来越广泛,患者受益越来越显著。然而,第三代试管婴儿技术在临床上应用如何?面临着哪些困境?在全面二孩时代,企业是如何推动我国第三代试管婴儿技术的发展?

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概述

三十多年来,辅助生殖技术的发展经历了常规的“试管婴儿”(体外受精和胚胎移植)、卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)、胚胎移植前基因(遗传学)诊断,再到囊胚培养、卵子和精子冷冻、卵母细胞体外成熟技术等,这些技术是现代科学的一项重大成就,开创了胚胎研究和生殖控制的新纪元。

试管婴儿的三大时代

试管婴儿技术出现后经历不断发展的过程,相继出现三代试管婴儿技术。“第一代试管婴儿”也称常规试管婴儿技术,是为了解决女性因素导致的不孕问题,如输卵管、内分泌、宫腔问题等而诞生的。这种技术将精子与卵子放在体外共同培养,靠精子和卵子的自由结合来实现受精过程。

“第二代试管婴儿”是为了解决由于男性因素导致的不育问题,它又称卵母细胞胞浆内单精子显微注射,通过直接将精子注射入卵母细胞胞浆内,来达到助孕目的。如果男方精子数量稀少或没有足够的活动量,或即使有了足够的活动量,精子也不愿意与卵子结合,这种情况下第二代试管婴儿技术可以大显身手。

“第三代试管婴儿”也称胚胎植入前遗传学诊断,指在胚胎移植前,取胚胎的遗传物质进行分析,诊断胚胎是否有异常,然后筛选健康胚胎移植。

技术发展所需,现实所迫——PGD/PGS技术应运而生

2012年中国人口协会发布的调查结果显示,目前我国不孕不育患者已经超过4000万,占育龄人口的12.5%。据“2009中国不孕不育现状调研报告”:不孕不育的发病率达15%,病因有上百种、治愈率仅34%,试管婴儿平均成功率为 20-30%,不孕不育患者治疗失败约占66%,而这些病因中有50%以上的遗传因素导致。

近年来,随着进行辅助生殖助孕的患者越来越多,临床发现在辅助生殖过程中部分高风险夫妇的胚胎易出现反复种植失败或者不明原因流产的情况,试管婴儿的总体活产率不到30%。而研究发现胚胎染色体异常时导致试管婴儿失败的主要原因。

2012年《Fertility and Sterility》:对2,282枚反复流产患者的胚胎进行分析,显示胚胎整倍体的概率仅占35%

2010年,《Fertility and Sterility》杂志上的研究对113份极体和73份囊胚染色体检测,结果发现非整倍体率分别为65.5%和45.2%

此外,2016年《Fertility and Sterility》杂志上的文献表明,随着女性年龄增加,胚胎整倍体概率显著下降,超过35岁后,整倍体概率直线下降,试管婴儿活产率不到40%。单纯的形态学评价已不足以实现真正选择染色体核型正常的胚胎植入,因此,临床上希望通过一定的技术手段能够在胚胎植入前对胚胎进行筛选,选择健康的胚胎进行植入,从而提高试管婴儿的妊娠率和活产率。

第三代试管婴儿技术又称为PGD/PGS技术,针对单基因遗传以及染色体结构和数目异常的检测,准确率达99%以上。在临床辅助生殖方面,起到关键的指导作用。在国外,通过使用PGS技术能够将活产率提高至70%的水平,因而我国亟需PGD/PGS技术来更好地实现健康生育。

试管婴儿技术发展史

GIFT:配子输卵管内移植;ZIFT:合子输卵管内移植法;PZD/SZI:透明袋开孔法/透明带下注入法;ICSI:卵母细胞胞浆内单精子显微注射;PGD-FISH:通过荧光原位杂交技术进行胚胎植入前遗传学诊断;PGD-CCS:综合染色体筛查的胚胎植入前遗传学诊断

什么是PGD/PGS?

第三代试管婴儿技术主要分为两个方向,第一个是胚胎植入前遗传学诊断,即PGD,第二是胚胎植入前染色体筛查,即PGS。PGD是寻找特定染色体上的已知单基因疾病,PGS是以提高试管婴儿植入率和活产率为目的的早期产前筛查方法。

PGD侧重于胚胎着床前的遗传诊断,经过体外授精获得胚胎。检测物质主要是8细胞期的1个胚胎细胞或者囊胚期的3-5个胚胎滋养层细胞。检测用单细胞DNA分析法,一是聚合酶链反应(PCR),检测男女性别和单基因遗传病;另一种是荧光原位杂交(FISH),检测性别和染色体病。PGD用于临床检测越来越广泛,其主要应用于单基因病遗传病诊断,染色体异常诊断等。PGS技术是通过一系列的分子技术手段,针对胚胎染色体的数目和结构异常进行检测,从中筛选出在染色体水平正常的胚胎植入子宫,以期提高胚胎植入的成功率。整个试管婴儿的流程以及胚胎植入前检测点如下:

PGD/PGS的发展历程

(1)PGD的发展史

PGD可看作是最早期的产前诊断,是生殖医学与遗传学相结合的产物。

PGD为控制遗传患儿的出生、降低遗传率,探讨出生缺陷发病机制等提供了重要途径。

1967年Edwards提出了PGD的思想

(2)PGS的发展史

PGD已成功应用20余年,PGS针对染色体的异常筛查,晚于PGD发展,属于崭新领域,但随着新技术的发展及应用,PGS检测技术越来越多地应用于相关研究和临床检测中。

最早进行PGS检测的荧光原位杂交技术(FISH)具有快速、灵敏、准确等优点,但由于荧光显微镜只能同时观察部分探针的荧光信号,因此FISH只能对有限的染色体进行检测。

随后,随着全基因组扩增技术的发展,CGH技术更加全面的、将诊断范围扩展至全基因组范围检测,其原理主要是用不同荧光色标记待检测DNA和对照DNA,然后进行杂交,通过双色荧光强度进行对比分析信号。与FISH相比,其主要优点是可以检测所有染色体数目以及每条染色体各个位点遗传物质是否改变。但该技术在使用过程中需要对照DNA,并且根据荧光强度进行样本分析,其准确性相对较低。

最近,高通量测序的发展致使越来越多的研究使用二代测序技术进行PGS单细胞活检分析。2013年研究人员利用高通量测序技术对单细胞MDA全基因组扩增产物进行低覆盖度的全基因组测序,开展了人类胚胎细胞非整倍体筛查的临床前研究,发现在0.07倍的测序深度和5.5%的覆盖度下可以有效进行染色体非整倍体的确定,在进行活检囊胚滋养细胞测序的38个囊胚中,68%(26/38)为整倍体,32%(12/38)为非整倍体(15.8%为数目异常,10.5%的样本检测为非平衡易位,5.3%的样本既是非整倍体又是结构异常),其检测结果准确性与array CGH的结果完全吻合。

越来越多的PGS使用二代测序技术进行胚胎活检样本检测,这说明随着技术的不断发展,PGS也得到越来越多的应用。PGS为避免反复流产、降低遗传患儿的出生、以及临床体外辅助生殖有重大意义。

PGD/PGS的检测范围

(1)PGD——单基因疾病诊断、染色体异常检测、其他

PGD主要应用于单基因病、X染色体连锁遗传和已知的染色体异常检测,以及一些其他疾病等,其多应用于具有明确遗传缺陷的病人。

较常见的单基因遗传病有血友病、白化病、进行性肌营养不良、苯丙酮尿症等。根据遗传类型分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁显性遗传、X连锁隐性遗传和Y连锁遗传五个类型。单基因病遗传类型不同,检测方法也不同。PGD进行单基因遗传病的检测方法主要是通过PCR方法,2005年我国研究人员应用荧光定量PCR技术对地中海贫血进行PGD检测,结果选择非地中海贫血的胚胎移植到子宫,避免妊娠一个地中海贫血胎儿。2009年研究人员利用PGD技术对杜氏肌营养不良携带者进行临床治疗,阻止不良患儿的出生。

PGD检测技术可以诊断体外辅助生殖过程中染色体异常的胚胎,使这些异常胚胎避免植入,预防反复流产以及生出不健康的婴儿。2007我国研究人员利用荧光原位杂交技术,成功对1例Y染色体微缺失患者进行了PGD,避免Y染色体微缺失胚胎植入,并顺利分娩1健康女婴。2011年,郑州大学第一附属医院生殖中心通过单核苷酸多态性微阵列技术对1例平衡易位携带患者的PGD试管婴儿助孕治疗,筛选染色体正常的胚胎进行植入,并于2012年3月成功分娩一健康女婴。这些实例说明,PGD可以用于胚胎染色体异常检测,辅助体外生殖。

PGD除了单基因遗传病和染色体异常疾病诊断外,也可用于HLA分型检测。2004年研究人员针对中国人16种β地贫突变类型和8种常见的HLA-DRB1基因型,建立了稳定的单细胞多重巢式PCR检测技术,可同时检测β珠蛋白基因,与β珠蛋白基因紧密连锁的STR基因及HLA-DRB1基因,并对4例已出生重型β 地贫患儿的患者进行了β地贫HLA配型的PGD治疗。

全世界遗传性疾病有 4000余种,目前通过使用第三代试管婴儿技术,能筛选甄别和检测的遗传性疾病达确定的多达72种,具体有以下疾病:

Addison病(并有脑硬化)血管角质瘤Fabry病
肾上腺脑白质营养不良先天性白内障
肾上腺发育不良小脑共济失调
血球蛋白血病(Bruton型)小脑共济失调
血球蛋白血病(瑞士型)扩散性脑硬化
眼部白化病腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth,CMT)
白化病—耳聋综合征无脉络膜症
Wiskott-Aldrich综合征脉络膜视网膜病变
Alport综合征色盲(绿色系列型)
釉质生长不全(成熟低下型)胆囊纤维化和血友病
釉质生长不全(发育不良型)肾源性尿崩症
遗传性低色素性贫血尿崩症(神经垂体型)
先天性角化不良低磷酸血性佝偻病
外胚层发育不全(无汗型)鱼鳞癣
Ehlers-Danlos综合征(第V类型)色素失节症
面生殖发育不全(Aarskog综合征)Kallmann综合征
局灶性皮肤发育不良Spinulosa毛囊角化病
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症Lesch-Nyhan综合症
糖原贮积(第VIII类型)Lowe(眼脑肾)综合症
性腺发育不全(xy女性类型)视网膜黄斑营养不良
慢性肉芽肿病Menkes综合症
血友病A智力迟缓(FMRI型)
血友病B智力迟缓(FRAXE型)
脑积水(中脑水管狭窄)智力迟缓(MRXI型)
小眼症(并有多种畸形)(Lenz综合症感觉性聋症(DNFZ型)
黏多糖贮积病II(Hunter综合征)磷酸甘油酸激酶缺乏
肌营养不良(Becker型)磷酸核糖焦磷酸合成酶缺乏
肌营养不良(Duchenne型)Reifenstein综合症
肌营养不良(Emery-Dreifuss型)视网膜色素变性
肌小管肌病痉挛性麻痹
先天性静止性夜盲症脊椎肌萎缩
Norrie’s(假性神经胶质瘤)迟发性脊椎骨骼发育不全
眼球震颤(眼球运动的或抽动的)睾丸女性化综合征
鸟氨酸甲酰转移酶缺陷症(高氨血症第I类型)遗传性血小板减少症
口-面-指(趾)综合症(第I类型)甲状腺素-结合球蛋白缺乏或变种
感觉性聋症(并有共济失调和丧失视力)Xg血型系统

(2)PGS的筛查范围

PGS主要对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测,通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目,分析是否存在染色体数目异常(三体、单体和多体)以及结构异常(染色体缺失或重复)。随着检测技术的不断发展,PGS检测技术可以在全基因组范围内进行染色体数目及结构筛查。

1995年,FISH首次快速应用于一些遗传学性的染色体异常检查,其检测范围只能是固定的一些染色体,未能够针对全部染色体进行检测。随着全基因组扩增技术的发展,2015年研究人员通过SNP和CGH技术对PGS样本检测,结果表明至少可以检测3M以上的缺失或者重复。结合全基因组扩增技术和高通量测序技术的发展, 2013年研究人员通过对已知男方为单基因显性遗传病患者进行体外辅助生殖,获取18枚质量好的胚胎,利用二代测序平台对胚胎中极少量细胞进行PGS检测,选择正常胚胎植入女性子宫内,并生育出健康婴儿。

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现状


与国际相比,尽管我国辅助生殖技术起步比世界首例晚了10年,但近年来我国通过第三代试管婴儿技术获得的成果越来越显著,这对实现健康生育起到举足轻重的作用。

2015年,解放军总医院耳鼻咽喉研究所所长王秋菊教授和山东大学附属生殖医院陈子江教授引领团队利用PGD技术成功阻断GJB2基因突变致遗传性耳聋的垂直传递,实现了我国首例成功阻断重度遗传性耳聋第三代试管婴儿的诞生。

2016年1月,我国首例应用核型定位(Karyomap)基因芯片技术进行“植入前单基因病诊断(PGD)”的试管婴儿诞生。2016年2月,我国首例胚胎植入前遗传学诊断枫糖尿病基因健康双胎试管婴儿于解放军总医院诞生,标志着我国对枫糖尿病单基因遗传疾病的产前诊断及干预已上升到新的台阶。

临床难点

尽管技术的进步不断解决了PGD/PGS临床上存在的问题,然而PGD/PGS在临床上应用还面临着很多困难。

PGD/PGS主要针对高龄(>36周岁)、习惯性流产(流产次数>2次)、反复植入失败(>3次移植高质量胚胎或多次移植,胚胎总数>10的种植失败)的病例。然而,目前对于高龄患者是否需要进行PGS检测,临床上还存在很大的争议。

在临床操作上,PGD/PGS存在着一定的难点。例如PGD/PGS活检可分为卵裂球活检和囊胚活检,这两种活检时间存在各自的优缺点。此外,PGD/PGS技术涉及的流程较多,中间环节易发生人为操作的误差,因而检测流程和控制也是该技术临床上面临的障碍之一。

遗传咨询是PGD/PGS临床化的关键环节,必须由获得遗传咨询师证书的专业咨询人员进行临床咨询。然而,目前存在的问题体现在临床一线遗传咨询师的短缺和相关知识,尤其是对检测报告的解读、遗传学诊断和临床处理策略方面相关知识的匮乏,这也是当前PGD/PGS临床化急需解决的障碍。

临床争议

自问世以来,PGS临床争议一直不断。对于高龄患者是否要进行PGS检测,目前还存在很大的争议。在2007年至2008年间,《新英格兰杂志》和《Human Reproduction》上的研究显示,尽管对高龄女性进行PGS选择健康胚胎移植,胎儿出生率并没有增加。此外,《Fertility and Sterility》杂志也于2010年刊文表示不支持对高龄女性进行PGS检测。

2007年NEJM:PGS不但不能增加反而明显降低了继续妊娠率和胎儿出生率

然而,随着二代测序技术及芯片技术的发展,PGS提高胚胎植入率和活产率逐渐被证实。2015年,《PLoS One》对过去通过全染色体筛查进行胚胎植入前检测的40多个临床试验进行了Meta统计分析,通过对一万例左右样本的统计分析,证实了PGS检测可显著提高植入率、妊娠率和活产率,平均提高30%左右,而流产率和多胎妊娠率显著下降,最多下降可达80%。2016年《Human Reproduction》上的研究表示多中心PGS检测后的胚胎临床结果一致,这意味着PGS检测技术可以推广应用。

2015《PLoS One》:Meta统计分析证实,PGS显著提高植入率、妊娠率、活产率

2016年《Human Reproduction》:多中心PGS检测后的胚胎临床结局一致,说明PGS检测技术可以推广应用

尽管目前有很多PGS提高植入率和活产率的报道,但仍有较多的随机对照研究得不到足够的证据证明PGS能有效改善植入率和活产率,加上胚胎嵌合的可纠正性、PGS活检操作和高费用问题,PGS仍受到争议,仍需要更大规模的临床随机研究支持。

国际PGD/PGS指南

2004年PGD国际协会颁布了PGD技术指南,并于2008年修正了PGD操作流程及实验室质量保障指南,就PGD实验室建立、标本取材、诊断技术、胚胎移植、质量控制与保障、遗传咨询与随访等提出了建议。欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)PGD联盟就PGD实验室的设立及相关的3项技术:DNA扩增技术、荧光原位杂交(FISH)技术、胚胎活检建立了相关指南。2015年,Tur-Kaspa等提出了用于HLA配型的PGD指南,有助于指导PGD技术在选择与罹患血液系统疾病、急需脐带血干细胞(骨髓)移植患儿的父母选择HLA配型符合的胎儿中的规范应用。作为高加索人群中最常见的单基因遗传病,囊性纤维瘤在欧洲人群中的患病率为1/4000,Girardet等2015年则提出了囊性纤维瘤PGD指南,可作为单基因病PGD技术指南参考。这些指南有助于规范PGD技术,并建立符合中国国情的PGD技术规范和指南。(本段选自《 中国实用妇科与产科杂志》)

PGD国际协会颁布了PGD技术指南

Tur-Kaspa等提出了用于HLA配型的PGD指南

Girardet等2015年则提出了囊性纤维瘤PGD指南

为了规范PGS市场检测行为并制定操作指南,成立于1944年的国际知名的加拿大妇产科医生协会(SOGC)在2015年5月发布了胚胎植入前基因诊断和筛查技术指南性文件“Technical Update: Preimplantation Genetic Diagnosis and Screening”,以替代2009年8月发布的第232号文件。文件中明确了PGD及PGS技术的临床应用价值。

2015年SOGC发布了胚胎植入前基因诊断和筛查技术指南性文件

其中文件的指导性意见如下:

1.在进行胚胎植入前遗传学诊断前,必须由有资质的遗传咨询师提供遗传指导,确保患者充分理解产生出生缺陷儿的风险,疾病对孩子的影响以及可选择的胚胎植入前诊断和产前诊断各自的优点和局限性。(III-A)

2.如果胎儿可能产生的异常可以由单个细胞或者多个滋养层细胞检测出来,患者夫妇应该被告知胚胎植入前遗传学诊断可以减少由父母一方或双方异常导致胎儿异常的风险。(II-2B)

3.由于胚胎植入前诊断技术的局限性以及可能导致的错误结果,提倡进行侵入性产前检测或产后检测,以确认胚胎植入前遗传学诊断的结果准确性。(II-2B)

4.相对于卵裂球活检,目前滋养层细胞活检对胚胎发育没有明显影响,因此,尽可能的选用滋养层细胞进行检测,并推荐由有经验的人进行操作。(I-B)

5.对于单基因病的胚胎植入前诊断,尽可能使用多重PCR的技术对胚胎滋养层细胞进行活检。(II-2B)

6.对携带染色体易位的夫妇,推荐在胚胎植入前对胚胎滋养外胚层细胞进行所有染色体异常进行筛查,因为在这个方面已经有大量的临床证据证明胚胎植入前检测能够带来良好的临床效果。(II-2B)

7.在进行胚胎植入前遗传学筛查(PGS)前,必须由认证的遗传咨询师对夫妻双方提供教育、技术介绍以及专业的遗传咨询,以确保夫妻双方能够充分了解此项技术,包括技术优势、局限性、发生错误风险以及目前在PGS是否能够提高IVF活产率方面的争论。(III-A)

8.由于已经有临床试验证实利用荧光原位杂交技术(FISH)对发育到第3天胚胎进行PGS检测会导致活产率的下降,因此该技术不应在用于胚胎植入前筛查。(I-E)

9.在胚胎植入前,对发育到囊胚阶段的胚胎进行所有染色体异常进行检测,能够提高植入率,有利于IVF周期的胚胎选择以及具有良好的预后效果。(I-B)

注:指导性意见发布的依据。

意见的标准:

I:至少有一个科学随机临床试验验证。

II-1:经过科学设计的对照试验证实。

II-2:经过精心设计的队列(前瞻性或回顾性)或病例对照临床试验证实,最好是经过了多中心的临床试验。

II-3:经过在不同时间不同地点的多个临床试验进行比较分析得出的综合结论,或者那些虽然没有进行疾病对照临床试验,但是在临床试验中对疾病取得了显著效果。

III:权威专家的建议,临床经验,专家委员会的描述性研究或报告。

意见的分类:

A:有充足的证据推荐临床应用。

B:有合理的证据来推荐临床应用。

C:现有的证据是相互矛盾的,不允许做出有效建议或反对临床应用;需要综合多种因素考虑。

D:有充足的证据不推荐临床应用。

E:有合理的证据不推荐临床应用。

L:没有足够的证据推荐使用,需要综合多种因素考虑。

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